新冠病毒核酸檢測為什麼會出現假陰性?
本文擬從檢驗前、中、後程序分別說明新冠病毒核酸檢測出現假陰性的可能影響因素。
1. 檢驗前患者樣本的影響
採到的病人檢體中病毒越多，就越容易檢測出來，但是要採到足夠的病毒量，會受到下列因素影響。
1.1 病毒自身特性和病人病程的影響
新冠病毒疾病的病程到現在還不完全清楚，尚須更多的臨床數據
，才能摸清正確的病程；即使摸清了病程，也可能存在個體差異。病人體內各器官和分泌物（上呼吸道、下呼吸道、糞便、血液、唾液等）的病毒量是多少，和病程有什麼關聯性，這都不是短期內可以解決的課題。
，才能摸清正確的病程；即使摸清了病程，也可能存在個體差異。病人體內各器官和分泌物（上呼吸道、下呼吸道、糞便、血液、唾液等）的病毒量是多少，和病程有什麼關聯性，這都不是短期內可以解決的課題。
如果病人所處的病程所攜帶的病毒量本來就很少，那麼，想要採到足夠的病毒量供檢測，也是做不到。至於病人攜帶的病毒量檢測不到，是否表示病人的感染性也會相對較低，目前其實也不知道。
以上說明或可解釋為什麼有些病人早期檢體沒檢測到病毒(陰性結果)，採了三、四次才檢測出來(陽性結果)。那是因為病人早期的檢體所含病毒量太低，或者根本就沒有病毒，因此檢測結果為陰性。
1.2 採到之病人檢體的影響
根據《新型冠狀病毒實驗室檢測技術指南》，採集的檢體種類包括上呼吸道檢體（咽喉拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物）、下呼吸道檢體（深咳痰液、呼吸道抽取物、支氣管灌洗液、肺泡灌洗液、肺組織切片檢體）、血液標本、血清標本，還有糞便和肛門拭子。
醫檢師期待收到好的檢體，才能檢驗出正確可信的結果。但這些檢體是由門、急診篩檢站或負壓隔離病房的醫護人員負責採集，在防疫的重大心理壓力之下，採樣的醫護人員面對患者，不一定都能採到好的檢體。
下呼吸道檢體應是最好的檢體，病毒量多，較容易檢測出來，但目前篩檢個案的採樣應以上呼吸道的咽喉拭子為主。因為上呼吸道採樣容易，對採樣的醫護人員和患者都方便；但因為上呼吸道檢體中的病毒量較少，便容易出現假陰性。一個單一的陰性檢測結果，特別是來自上呼吸道的樣本，不能排除新型冠狀病毒感染。WHO建議可能需要對樣本進行多次檢測。
對於嚴重或進展性疾病，強烈建議重複取樣和檢測下呼吸道檢體
。即使檢測到另一種病原體，也不能排除新型冠狀病毒的感染，因為目前對其混合感染的作用知之甚少。
。即使檢測到另一種病原體，也不能排除新型冠狀病毒的感染，因為目前對其混合感染的作用知之甚少。
1.3 標本保存和運送等的影響
新冠病毒是單鏈RNA病毒，容易死亡和降解。在檢體採集後運送到實驗室的過程中，要是沒有低溫(4℃)保存，運送時間如果又很長(超過24小時)，那麼病毒可能死亡，核酸降解後就容易造成假陰性。
實驗室的待檢檢體可保存在4℃(採檢後72小時內)，如未能在時間內完成核酸萃取，則應保存於-70℃。
實驗室的待檢檢體可保存在4℃(採檢後72小時內)，如未能在時間內完成核酸萃取，則應保存於-70℃。
2. 檢驗中程序的影響
2.1 試劑偵測極限(或敏感度)
的問題
並不是只要有一個病毒，試劑就能檢測出來，只有在採到的病人檢體中含有足夠的病毒量(即達到某個測定值)，才能檢測出檢體中的新冠核酸。
一個病毒可能檢測不到，但當有一千個病毒時，那就檢測得到，這就是試劑的偵測極限。偵測極限取決於檢驗的方法原理，不是由操作者主觀認定。新冠病毒核酸試劑的偵測極限越低，也可以說偵測敏感度越高，假陰性會越少。
2.2 病毒去活化的影響
出於生物安全的考量，為了操作醫檢師的安全防護，有些實驗室可能會先將病毒進行去活性(deactivation)及溶解病毒顆粒後再做後續的實驗。若採取去活化及溶解病毒程序不完全，有可能會讓檢驗陽性率降低。
2.3 核酸抽取的影響
檢驗中程序的RNA提取和PCR過程，也會因不同操作人員或者使用的試劑以及設備的不同，而產生一定的影響。還好這類影響均可利用加強各種品管程序加以控制。例如用human house-keeping gene做internal
control PCR。
3. 檢驗後結果判讀的影響
目前新冠病毒的核酸檢測主要有兩個方法，一為Real-time
RT-PCR檢測法，另一為定序法。因為Real-time
RT-PCR更快，所以現在大部分都是使用Real-time
RT-PCR。完成檢驗後需要對結果進行判讀。
Real-time RT-PCR採用的檢測特異性基因組序列各國有所不同。依WHO
公佈之資訊，顯示中國大陸使用開放閱讀框1ab（open reading frame，ORF1ab）、核殼蛋白（nucleocapsid protein，N）基因。美國CDC給的是三段N基因(N1,
N2, N3)。台灣CDC protocol
是使用
RdRP, E, N三段基因，與德國使用相似。(E代表envelop)
結果的判讀會因為各實驗室標準不同而有些許差異。當結果存在任何疑慮時，檢體應重做一次，或重新採樣再做。
結語
基本上任何檢驗方法或多或少存在假陰性和假陽性的問題。新冠病毒核酸檢測出現假陰性是不可避免的。醫檢師宜充分了解所用方法的偵測極限和影響因素，當懷疑檢驗結果的正確性時，具有分析可能原因和判斷是否需要重做的技術能力，必能提升新冠病毒核酸檢測的檢驗品質。
作者∶蔡宗仁 2020.02.22
感謝高全良老師審閱，特此致謝。
